维普资讯 中华 临床 免 疫 和 变 态 反应 杂 志 CHINESEJOURNAL0FALU￡RGY CUNICAL IMMUNOLOGY · 基础研究 · 放射过敏原吸附抑制实验评价过敏原提取液的总效价 王瑞琦 ，张宏誉 (中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院变态反应科，北京 100730) 摘要 ：目的 用放射过敏原吸附抑制实验评价过敏原提取液的总效价。方法 制备蒿属花粉过敏原提取液室 内参考品 (IHR)，并依据相同的操作规程制备蒿属花粉提取液A，以及A的lO倍稀释液B。分别进行放射过敏原 吸附抑制实验 。绘制抑制 曲线％抑制所需过敏原稀释度 。结果 蒿属花粉 IHR以及提取液 A和 B的抑制 曲线斜率差异无显著性，达到 50％抑制所需 IHR稀释度为 10问，50％抑制所需提取液A、B的稀释度分别为 10-一-、 10一，与 IHR比较，提取液A、B的相对效价分别约为 1和0．1。结论 放射过敏原吸附抑制实验可评价过敏原提 取液的总效价 。通过与标准 品或室 内参考品的比较可进行过敏原的质量控制。 关键词 ：放射过敏原吸附抑制实验 ；过敏原提取液 ；总效价 中图分类号 ：R392．8 文献标识码 ：A 文章编号 ：1673—8705(2007)02．0150-04 EvaluatetheTotalPotencyofAllergenExtractbyRadioallergosorbent TestInhibition WANG Rui—qi；ZHANG Hong-yu (DepartmentofAllergy，PUMCHospital，CAMSandPUMC，Beijing100730，China) Objective Toevaluatethetotal potencyofallergen extractbyradioallergosorbenttest(RAST) inhibition．Methods Thein-housereference(IHR)ofmugwortpollenexrtactwasprepared．Mugwort pollenexrtactA waspreparedfollow thesanleoperationprocedure．10-folddilutedexrtactA wasdefinited asexrtactB．RAST inhibitionwasdone．Theinhibitioncurveswasprotractedandthe50％ inhibition dilutionwascalculated．Results Th erewasno significantdifferencebetween theslopeofIHR andthe slopeofexrtactA andB．50％ inhibitiondilutionofIHR was104m。50％ inhibitiondilutionofextractA nadBwas10-3耵·and 10-2·＆separately．Compraedwith IHR．hterelativepotencyofextractA nadB was1 nad 0．1approximately．Conclusions The total potency ofallergen exrtactcan be evaluated by RAST inhibition．Qualityconrtolofallergenexrtactcanbedonebasedontherelativepotencycomparetohte standradizationorthein．housereference． ’ Keywords：radioalhrgosorbenttestinhibition；allergen extract；totalpotency ChinJAl~rgyClinlmmunol，2007，1(2)：150—153 过敏原提取液 的标准化是 国内外研究的热点， 附抑制实验 (radioallergosorbenttestinhibition，RAST 直接关系到临床诊断的准确性和脱敏治疗 的有效 inhibition)可评价过敏原提取液的总效价 ，是 国际 性。过敏原标准化的方法很多，其 中放射过敏原吸 公认的过敏原标准化方法[ 。本研究对用RAST #通信作者 电线电子邮件 ：．ca l5O December 2007 维普资讯 放射过敏原吸附抑制实验评价过敏原提取液的总效价 抑制实验进行过敏原提取液的质量控制进行了实践。 包被了蒿属花粉过敏原的ImmunoCAP：包被了青霉 素G的ImmunoCAP；其他相关试剂包括 ：特异性IgE 材料和方法 的曲线标准品、曲线质控品、抗 IgEImmunoCAP、 酶标二抗、底物、终止液、清洗液等；上述仪器和 材料 试剂均为PHADIA公司生产。 蒿属花粉提取液：取 2001年采集的蒿属花粉 方法 (收购 自北京市平谷区)1g与Coca’S液 (NaC10．5％、 蒿属花粉提取液 的稀释 ：用 Coca’s液对蒿属 NaHCO30．275％、苯酚 0．4％、pH8．2)20ml混合 ， 花粉 IHR以及提取液 A、B分别倍 比稀释至 10～、 4~C振荡提取24小时；4~C3000r／min离心 15分钟， 10～、l0一、l0～、10 倍，原液以1o0表示。 取上清 ，过滤去除杂质；超滤 (MIⅢ POREAmicon 蒿属花粉特异性 IgE测定 ：以上述原液及稀释 Ultra一15离心超滤管 ，截 留相对分子质量 10000) 液各 100 1分别与蒿属花粉特异性 IgE阳性血清池 4~C、4000r／min离心 6小时 ：超滤产物加 Coca’s 100 l混合 ；同时以阳性血清池 100 1与 Coca’s液 液至总蛋 白含量 2mg／；除菌过滤 (MILLIPORE 100 l混合，作为阳性对照；以阴性血清池 100 1 MiUex．GS0．22 m)；分装，一20℃冻存 ，制成蒿属 与Coca’S液 100 混合 ，作为阴性对照；上述混 花粉提取液室 内参考品 (in．houseYe~rence，IHR)。 合液均4℃孵育 12小时后 。测定蒿属花粉特异性 取 1998年采集的蒿属花粉 (收购 自北京市平谷区) 1只E，记录荧光强度PG电子通信 。 同上制备蒿属花粉提取液A．将A稀释 10倍得到 青霉素对照特异性 IgE测定：以蒿属花粉 IHR 提取液 B。 原液及 10 稀释液各 100 1分别与对照血清 100 l 蒿属花粉特异性 IsE阳性血清池 ： 由20份针 混合；同时以对照血清 100 l与 Coca’S液 100 l 对蒿属花粉过敏的患者血清 (于2003年 7 9月来 混合 ，作为阳性对照 ；以阴性血清池 100 与 我科就诊者)等量混合而成，一20℃冻存。入选条 Coca’8液 100 l混合，作为阴性对照；上述混合液 件为：有典型的花粉症临床表现：针对蒿属花粉的 均4~C孵育 12小时后 。测定青霉素G特异性 ZgE， 皮肤试验呈 中度以上的阳性反应 ．或蒿属花粉激发 记录荧光强度 。 试验呈 阳性反应 ：针对蒿属花粉 的特异性 IgE≥ 统计学处理 3．5KUA／L。 阳性对照和阴性对照荧光强度分别以P和 N表 蒿属花粉特异性 IgE阴性血清池 ：由 10份针 示 ．被过敏原抑制后 的阳性血清池荧光强度 以I 对蒿属花粉不过敏的正常人血清 (于2003年 7～9 表示，抑制率= [(P～N)一(I—N)]／(P—N)X100％， 月来我科就诊者)等量混合而成 ，一20℃冻存。入 当抑制率的计算值小于 0时，近似计为 0。以过敏 选条件为：无花粉症的临床表现：针对蒿属花粉的 原稀释度 的对数为横坐标 ，以抑制率为纵坐标 ， 皮肤试验呈阴性反应 ；血清总 IgE6OKUdL；吸 绘制抑制 曲线 ，并作直线 回归 。对相关系数进行 人物过敏原过筛试验 (Phadiatop)阴性 ；针对蒿属 显著性检验 ；对各 回归直线的斜率进行 比较 ；由 花粉的特异性 IgE0．35KUA／L。 直线％抑制所 需过敏原稀释度 的 对照血清 ：对青霉素过敏 的患者血清 (于2003 对数 ，求其反对数 ，即得到 50％抑制所需过敏原 年 7～9月来我科就诊者)1份 ：无花粉症的临床 的稀释度 。 表现 ；针对蒿属花粉 的皮肤试验呈 阴性反应 ； Phadiatop阴性 ；针对蒿属花粉的特异性 IgE0．35 结 果 KUdL；针对青霉素G的特异性 IsE≥3．5KUdL。 上述血清均为人类免疫缺陷病毒抗体阴性 ：梅 青霉素对照特异性 IgE抑制实验结果 毒螺旋体抗体阴性；乙型肝炎表面抗原阴性；丙型 青霉素对照特异性 IgE测定结果为N青霉素=23， 肝炎抗体阴性；谷丙转氨酶40U／L。 P青霉素=2567，用蒿属花粉 IHR原液和 l0 稀释液 仪器和试剂 ：UniCAP100~过敏原检测系统： 与对照血清混合孵育后 ，测得荧光强度分别为 Vo1．1No．2 151 维普资讯 中华 临床 免 疫 和 变 态 反 应 杂 志 2665和2647，抑制率均近似为 0．00，即蒿属花粉 YB=O．179XB+96．9％。相关系数分别 为 rn==0．925、 过敏原提取液对青霉素G特异性 IgE无抑制。 rA=0．928、rs=0．982，均具有统计学意义，各直线斜 蒿属花粉特异性IgE抑制实验结果 率的差异无显著性 。达到 50％抑制所需蒿属花粉 蒿属花粉特异性IsE测定结果见表 1(N蓠_花粉= IHR以及提取液 A、B的稀释度分别为 10-3-一-、10一、 20，P篙属花粉=2669)，抑制 曲线．~o提取液 A与 IHR 比较相对效价约等于 1 IHR以及提取液A、B的抑制 曲线 )，提取液B与IHR比较相对效价约等 分别为Y~--0．163X腿+108．9％、Y^==0．164X^+l08．5％、 于 0．1(10-3．61／10 成)。 表 1 蒿属花粉特异性IgE测定结果 Table1 ResultsofspecificIgE tomugwortpollen IHR：蒿属花粉提取液室内参考品 美 国。PNU已被所有过敏原生产商用于过敏原提取 100 液的标定 。但是，由于提取液中含有的蛋 白质成分 75 众多，其 中大部分并不具有过敏原活性；而且，由 于提取条件和保存条件的不同，提取液中的蛋 白质 姗 50 含量和活性都会有很大差异 。故仅用Noonunits和 瑶 器 PNU进行过敏原提取液的标准化具有局限性。随着 25 免疫学技术的发展 。已可对过敏原提取液 中的主要 致敏蛋白进行分离和纯化 ．用其多克隆或单克隆抗 0 — 5 —4 —3 —2 一l O 体检测提取液 中的主要致敏蛋 白含量 。以主要致敏 过敏原提取液稀释度的对数 (1sc) 蛋 白含量为标准进行过敏原提取液的标准化。但 豳 1 蒿属花粉特异性 lsE抑制曲线 是 。由于致敏蛋白种类繁多，要对提取液 中的所有 1 InhibitionetlrveofmugwortpollenspecificIsE 致敏蛋白进行定量有很大困难 ，故本方法仅适用于 少数几种致敏蛋白种类 明确的过敏原。由于过敏原 讨 论 提取液是用于过敏患者的诊断和治疗 ，故标准化的 最直接的方法就是在过敏患者身上进行定量的皮肤 RAST抑制实验可用于评价过敏原提取液 的总 试验 。根据皮肤反 应 的大小计 算其 生物 活性 效价，是国际公认的过敏原标准化方法[1“]。最早 (biologicalactivity)。无论美 国还是欧洲 ，标准化的 的过敏原标准化方法是 由Noon提出的。他用质量体 过敏原提取液大多是用生物活性标定的。但是，在 积 比为单位标定过敏原提取液，即 1g花粉加 1Oml 患者身上进行皮肤试验受很多因素的限制，比如试 提取液获得的花粉提取液含有 100000NoonU／ml。 验过程的复杂和耗时、受试者的皮肤条件、受试者 当人们认识到过敏原主要是蛋白质成分后，开始用 的知情同意等，对于不常见的过敏原，要找到足够 蛋 白氮单位 (proteinnitrogenunit，PNU)进行过敏 数量的受试者也有一定困难 [3]。 原标准化 ，即 1mg蛋白氮相当于 100000PNU。在 由于测定过敏原提取液的生物活性有上述 困 152 December，2007 维普资讯 放射过敏原吸附抑制实验评价过敏原提取液的总效价 难 ，故体外实验的方法被广泛用于过敏原提取液活 见 ，对于用相同原料遵循相同的操作规程制备的过 性的测定 ．RAsT抑制实验是常用方法之一 。RAST 敏原提取液 ，可以用 RAST抑制实验比较 50％抑制 的原理是 ：将包被有过敏原 的固相载体与血清反 所需过敏原稀释度 ．根据其与标准品或室内参考品 应 ，如果血清 中含有针对此种过敏原的特异性 IgE， 的相对效价标定生物活性[52。 则特异性 IgE与过敏原结合 。形成 “固相载体 ．过 综上 。RASPG电子通信T抑制实验可评价过敏原提

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